蛋白質(zhì)濃度測(cè)定常用比色法。其中，BCA法和Bradford法定量是最常用的蛋白濃度測(cè)定方法。每種蛋白質(zhì)定量方法都有其局限性，在選擇蛋白質(zhì)定量方法時(shí)，最需要考慮的特性是靈敏度、與樣品中常見(jiàn)物質(zhì)的相容性(如洗滌劑、還原劑、抑制劑、鹽和緩沖液)、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性和蛋白質(zhì)之間的差異等。
蛋白定量BCA法和Bradford法對(duì)比
| |
BCA法 |
Bradford法 |
| 測(cè)定范圍 |
20–2000 µg/mL |
100-1500 µg/mL |
| 檢測(cè)原理 |
在堿性的條件下，蛋白質(zhì)將堿性Cu(II)還原為Cu(I)。兩分子的二辛可寧酸（BCA）螯合一個(gè)Cu(I)，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該復(fù)合物的水溶液在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性 |
在試劑的酸性環(huán)境中，蛋白能與考馬斯染料結(jié)合。這導(dǎo)致染料的最大吸收發(fā)生位移，從紅棕色形式轉(zhuǎn)化為藍(lán)色形式。蛋白-染料結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下吸收最大 |
| 優(yōu)點(diǎn) |
兼容大多數(shù)去垢劑 |
蛋白定量方法中，測(cè)定最快速，方法最簡(jiǎn)單，且在室溫下進(jìn)行 |
| 蛋白質(zhì)間差異性小于Bradford法 |
與大多數(shù)鹽離子、溶劑、緩沖劑、硫醇、還原性物質(zhì)和金屬螯合劑兼容 |
| 缺點(diǎn) |
能還原銅離子的物質(zhì)也能造成顯色，影響定量的準(zhǔn)確性 |
與通常用于溶解膜蛋白的高濃度去垢劑不兼容 |
| 與銅離子螯合的試劑，DTT 等常見(jiàn)還原劑和特定的單個(gè)氨基酸也會(huì)在BCA檢測(cè)中顯色（半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸） |
與BCA法相比，蛋白質(zhì)之間的差異性較大 |
| 需要孵育溫度以及時(shí)間的消耗 |
- |
BCA法
試劑配制：
1、BCA試劑
A） 試劑A：分別稱取1%(w/v)BCA ，2%(w/v)Na2CO3·H2O，0.16%(w/v)Na2C4H4O6·2H2O，0.4%(w/v)NaOH，0.95%(w/v)NaHCO3，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。
B）試劑B：4%(w/v)CuSO4·5H2O。
C）BCA試劑：試劑A:試劑B=50:1,混合均勻。
2、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)（BSA）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)母液：配制成5mg/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液（配制溶液需與待測(cè)樣品溶液保持一致）。
實(shí)驗(yàn)操作：
1、配制標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)樣品：用標(biāo)液配置溶液稀釋BSA母液10倍，至濃度為0.5mg/ml。取96孔酶標(biāo)板，按下表加入試劑
| 序號(hào) |
1
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2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
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8
|
| 0.5mg/mlBSA溶液（μl） |
0
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1
|
2
|
4
|
8
|
12
|
16
|
20
|
| 標(biāo)液配置溶液（μl） |
20
|
19
|
18
|
16
|
12
|
8
|
4
|
0
|
| 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） |
0
|
0.025
|
0.05
|
0.1
|
0.2
|
0.3
|
0.4
|
0.5
|
每份標(biāo)樣分別加入BCA試劑200μl。
2、配制待測(cè)樣品：準(zhǔn)確吸取20μl樣品溶液于酶標(biāo)孔中，加入BCA試劑200μl。如待測(cè)樣品需稀釋，稀釋倍數(shù)需根據(jù)原始樣品濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，一般保證稀釋后樣品濃度標(biāo)曲濃度范圍內(nèi)。
3、樣品處理：輕搖，于37℃保溫30-60min，冷卻至室溫。
4、測(cè)定：以空白為對(duì)照，在酶標(biāo)儀上562nm處比色，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對(duì)照，根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。
BCA法試劑
| 產(chǎn)品號(hào) |
名稱 |
級(jí)別 |
Cas |
規(guī)格 |
| B107658 |
2,2'-聯(lián)喹啉-4,4'-二甲酸二鈉(BCA) |
98% |
979-88-4 |
1g,5g,25g |
| S113834 |
碳酸鈉，一水 |
ACS |
5968-11-6 |
1g,50g,250g |
| S111691 |
酒石酸鈉二元二水合物 |
AR, ≥99% |
6106-24-7 |
100g,500g |
| S111518 |
氫氧化鈉 |
AR,96%,顆粒狀 |
1310-73-2 |
500g,12*500g,20*500g |
| S112331 |
碳酸氫鈉 |
AR,≥99.8% |
144-55-8 |
500g,12*500g,20*500g,10Kg |
| C112396 |
硫酸銅，五水 |
AR,99% |
7758-99-8 |
500g,20*500g |
| A119741 |
牛血清白蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
98% |
9048-46-8 |
200mg |
Bradford法
試劑配制：
1、染色劑：0.01％考馬斯亮藍(lán)G250,8.5%磷酸和4.75%乙醇。
2、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)（BSA）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)母液：配制成10mg/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液（配制溶液需與待測(cè)樣品溶液保持一致）。
實(shí)驗(yàn)操作：
1、配制標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)樣品：
A）在BSA母液中加入標(biāo)液配置溶液，配置一組濃度分別為0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的BSA溶液。
| 序號(hào) |
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
| 10mg/mlBSA母液（μl） |
0
|
20
|
40
|
60
|
80
|
100
|
| 標(biāo)液配置溶液（μl） |
1000
|
980
|
960
|
940
|
920
|
900
|
| 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） |
0
|
0.2
|
0.4
|
0.6
|
0.8
|
1
|
B）對(duì)于上述配制好的BSA溶液，再用P標(biāo)液配置溶液分別稀釋10倍。
| 序號(hào) |
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
| 步驟A配置完成的BSA溶液（μl） |
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
| 標(biāo)液配置溶液（μl） |
900
|
900
|
900
|
900
|
900
|
900
|
| 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） |
0
|
0.02
|
0.04
|
0.06
|
0.08
|
0.1
|
C）分別移取50μl步驟B中配制好的一組待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液，滴加到孔板中，再分別加入200μl考馬斯亮藍(lán)G250。靜置10min后檢測(cè)。
2、配制待測(cè)樣品：準(zhǔn)確吸取50μl樣品溶液于孔板中，加入考馬斯亮藍(lán)G250試劑200μl。靜置10min后檢測(cè)。如待測(cè)樣品需稀釋，稀釋倍數(shù)需根據(jù)原始樣品濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，一般保證稀釋后樣品濃度在0.1-1.0mg/ml。
3、用酶標(biāo)儀在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度。以BSA含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對(duì)照，根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。
Bradford法試劑
| 產(chǎn)品號(hào) |
名稱 |
級(jí)別 |
Cas |
規(guī)格 |
| B104237 |
考馬斯亮藍(lán)G250 |
AR |
6104-58-1 |
5g,10g,25g,100g,200g |
| P112024 |
磷酸 |
AR, ≥85 wt. % in H2O |
7664-38-2 |
500ml,12*500ml,2.5L |
| A112717 |
乙醇(95%) |
AR,95.0% |
64-17-5 |
500ml,12*500ml,20*500ml,4*5L,10L,25L |
| P196987 |
PBS緩沖液 |
1× |
- |
500ml |
| P196986 |
PBS緩沖液 |
10× |
- |
100ml,500ml,1L |
| A119741 |
牛血清白蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
98% |
9048-46-8 |
200mg |