牛血清白蛋白是生化實(shí)驗(yàn)室最常用的蛋白之一，而實(shí)驗(yàn)中，可能因?yàn)樗^于常見、過于平凡而忽略了它的重要性。牛血清白蛋白(BSA)，又稱第五組分，是牛血清中的一種球蛋白，包含583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66.430 kDa，等電點(diǎn)為4.7。牛血清白蛋白在生化實(shí)驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用，例如在western blot中作為Blocking agent。
牛血清白蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
牛血清白蛋白前體蛋白全長607個(gè)氨基酸。前體蛋白從N端脫去18個(gè)信號(hào)肽，以及6個(gè)前肽，形成含有583個(gè)氨基酸、分子量約為66.5kDa的成熟BSA蛋白。BSA表面含有大量的酸性、堿性氨基酸。其中酸性氨基酸谷氨酸、天冬氨酸分別有40個(gè)、59個(gè)，堿性氨基酸賴氨酸、精氨酸分別有59個(gè)、23個(gè)。另外BSA還有35個(gè)半胱氨酸，形成17對二硫鍵，一個(gè)游離的巰基。
牛血清白蛋白的應(yīng)用
1、維持蛋白的穩(wěn)定性
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于“壓力”的狀態(tài)下，如加熱、紫外照射、氧化、剪切力等，蛋白質(zhì)的空間折疊趨于延展，導(dǎo)致內(nèi)部疏水位點(diǎn)暴露，發(fā)生無定形聚集或者形成高結(jié)構(gòu)化的淀粉樣蛋白，從而失去生物活性。BSA具有良好的熱穩(wěn)定性，當(dāng)溫度上升至65度時(shí)，其空間結(jié)構(gòu)的變化依然是可逆的。BSA另一個(gè)特點(diǎn)是能夠和許多物質(zhì)形成可逆結(jié)合，特別是水溶性較差的物質(zhì)，如脂肪酸、血紅素、膽紅素、帶負(fù)電荷的芳香化合物等，能夠增加其水溶性。因此，BSA是理想的蛋白保護(hù)劑。當(dāng)酶、或抗體等蛋白質(zhì)發(fā)生空間結(jié)構(gòu)變化，BSA能夠與其發(fā)生可逆結(jié)合，形成穩(wěn)定的、可溶的高分子復(fù)合物，防止蛋白發(fā)生無定形聚集。另外，溶液中的BSA能夠與容器表面結(jié)合，防止蛋白吸附在容器表面而濃度降低。
如1995年Chang等人發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是由蛋白表面的疏水性決定的。當(dāng)溫度升高時(shí)，酶的疏水位點(diǎn)暴露，溶液中的BSA與酶的疏水區(qū)域結(jié)合，從而維持酶的水溶性，防止發(fā)生聚集，有效提高酶的熱穩(wěn)定性。并且，疏水性越強(qiáng)的保護(hù)蛋白，對酶的保護(hù)作用越強(qiáng)。
2、免疫檢測當(dāng)中固相封閉蛋白
在免疫檢測過程中，需要將抗體固定在固相表面，如微孔板，磁顆粒、聚苯乙烯微球或硝酸纖維膜表面。由于蛋白是一種粘性較大的分子，檢測過程中，樣本中的雜蛋白會(huì)與固相表面的疏水位點(diǎn)發(fā)生非特異性結(jié)合，造成背景干擾。因此，需要將固相表面的多余位點(diǎn)用封閉劑將其封閉，常用的封閉劑，如BSA、酪蛋白、明膠等能夠吸附在固相表面，防止抗體、或者抗原與固相表面發(fā)生非特異性結(jié)合，降低檢測本底，提高靈敏度。
BSA是一種球蛋白，分子量約為66.5kDa，表面含有大量的氨基和羧基殘基，并且BSA的空間結(jié)構(gòu)能夠隨著溫度、pH、鹽濃度發(fā)生變化，是一種柔性分子。作為常見的封閉蛋白，BSA能夠與親水表面、疏水表面，以及活化的共價(jià)結(jié)合表面，如活化羧基、氨基、環(huán)氧基、甲苯磺酰基等結(jié)合，抑制非特異性吸附，是一種理想的固相封閉劑。
BSA表面含有大量的羧基、氨基，能夠用于表面的活化基團(tuán)結(jié)合，封閉多余位點(diǎn)，最為常見的是化學(xué)發(fā)光免疫磁珠偶聯(lián)抗體當(dāng)中的應(yīng)用。如用EDC活化羧基表面磁珠后，能夠和抗體表面氨基反應(yīng)，使抗體共價(jià)結(jié)合在磁珠表面。這一過程需要對多余的活化羧基位點(diǎn)進(jìn)行封閉，BSA分子尺寸更小，能夠進(jìn)入到表面抗體間的間隙，并且由于表面含有大量的氨基，與活化羧基反應(yīng)，封閉多余的活性位點(diǎn)。同時(shí)，BSA表面含有大量的羧基，還能夠改善磁珠的親水性。另外，BSA表面含有一定的氨基酸疏水殘基，如丙氨酸、亮氨酸等，也能夠?qū)Ρ砻娴氖杷稽c(diǎn)進(jìn)行封閉。
值得注意的是，Larsericsdotter等人研究發(fā)現(xiàn)，BSA在磷酸鹽溶液中，在固相表面吸附更為緊湊，形成的結(jié)構(gòu)也更為穩(wěn)定。這是因?yàn)?，磷酸鹽與BSA上的甘氨酸和精氨酸結(jié)合，能夠消除結(jié)構(gòu)性靜電排斥。因此BSA在磷酸緩沖液中結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，在固相表面具有更高的結(jié)合效率。